Alimentos Transgénicos

Sumário

O presente relatório foi elaborado no seguimento da visita de estudo efectuada pela turma ao laboratório aberto do IPATIMUP (Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto), no âmbito da disciplina de Biologia. Esta realizou-se dia 11 de Fevereiro de 2011, tendo-se iniciado às 08h05m, hora em que os alunos saíram da escola Didáxis Cooperativa de Ensino em direcção à estação de Caniços. Às 08h27m seguimos viagem de comboio com destino a Porto São Bento. Chegamos às 09h15m e de seguida a professora foi carregar os andantes de todos os alunos, apanhamos o metro e saímos na estação Pólo Universitário. Fizemos o caminho até ao laboratório aberto a pé.

A turma chegou ao laboratório aberto do IPATIMUP por volta das 10h. Foi aí que tivemos o primeiro contacto com as monitoras Rita Coelho e Estefânia Martins.

No decorrer do dia, fomos sujeitos a duas sessões de informação e esclarecimento sobre as actividades práticas a realizar. A primeira ocorreu, logo após a nossa chegada, foi sobre “O rastreio dos transgénicos” e de seguida seguiu-se a respectiva actividade. No fim desta, realizou-se um debate sobre as vantagens e desvantagens dos alimentos transgénicos. Findo o debate, às 13h, fomos almoçar ao shopping Campus São João. Voltamos ao laboratório às 14h30 e ocorreu a segunda sessão e actividade prática – “O Código da Vida: O Criminoso”.

Finalizadas todas as actividades, despedimo-nos das monitoras e dirigimo-nos até à estação do metro, de seguida à estação ferroviária Porto São Bento onde embarcamos no comboio das 17h15m, chegamos a Caniços às 18h06m, onde cada um se dirigiu para casa.

Desenvolvimento Teórico

Antes da realização desta visita os alunos leccionaram a matéria necessária para a mesma. Porém, como já referi, a doutora Rita e Estefânia foram-nos relembrando da mesma. As duas sessões de esclarecimento a que fomos sujeitos abordaram os seguintes temas:

Alimentos transgénicos

Os alimentos transgénicos são organismos que, mediante técnicas de engenharia genética (ciência responsável pela manipulação das informações contidas no código genético, que comanda todas as funções da célula), contêm materiais genéticos de outros organismos.

Figura  1: Soja, um dos alimentos transgénicos mais cultivados;

A geração de transgénicos visa organismos com características novas ou melhoradas relativamente ao organismo original. A aplicação mais imediata dos organismos transgénicos (e dos organismos geneticamente modificados em geral) é a sua utilização em investigação científica. Pois a sua expressão de um determinado gene de um organismo num outro organismo, pode facilitar a compreensão da função desse gene.

Assim sendo, podemos caracterizar alimentos transgénicos como alimentos cujo embrião foi modificado em laboratório, pela inserção de pelo menos um gene de outra espécie.

Enzimas de restrição

As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição são capazes de reconhecer pequenas sequências específicas de nucleótidos, cortando a molécula de ADN em locais específicos (zonas de restrição) e catalisando o desdobramento do ADN em fragmentos menores sem danificarem a molécula original. Esses fragmentos de ADN estão sob a forma de dupla hélice mas com uma pequena extensão em cada extremidade de ADN em cadeia simples. Estas porções terminais designam-se por extremidades coesivas.

As extremidades coesivas podem então ligar-se, por complementaridade, a outro ADN, sendo as enzimas intervenientes no processo designadas por ligases. Esta ligação é promovida por uma enzima chamada ADN ligase, que catalisa a ligação entre o grupo fosfato ligado ao carbono 5’ e o grupo hidroxilo ligado ao carbono 3’ das moléculas de desoxiribose presentes nos nucleótidos que constituem o ADN, numa reacção que para se dar necessita de ATP.

Figura 2: Esquema comparativo da acção de três enzimas de restrição;

A enzima Eco R1, por exemplo e como vemos na figura 2, reconhece a porção da hélice dupla 5’ GAA TTC 3’ e só cortará a molécula de ADN se encontrar esta sequência de bases nas duas cadeias e lidas sempre de 5’ para 3’, fazendo um corte entre o nucleótido de G e o nucleótido de A em cada cadeia (catalisam a destruição de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleótidos).

Reacção de polimerização – PCR (polymerase chain reaction)

A técnica de reacção em cadeia pela polimerase permite amplificar uma determinada porção de ADN. A polimerização em cadeia faz rapidamente replicações sucessivas de determinadas porções de ADN, actualmente já há máquinas capazes de executar esta operação (figura 3).

Figura 3: Termociclador;

Um ciclo de uma reacção de PCR envolve:

. Desnaturação da dupla hélice – é conseguida com a incubação do ADN a uma temperatura de 95ºC, formando duas cadeias simples a partir de uma dupla cadeia.

. Emparelhamento dos iniciadores – é necessário diminuir a temperatura aproximadamente para os 55ºC, para ocorrer a ligação dos pequenos fragmentos iniciadores (primers).

. Polimerização de ADN – ocorre a 70ºC, temperatura óptima de actividade da Taq polimerase. Esta liga-se na região dos iniciadores, e promove a polimerização, com elongação da cadeia de ADN, servindo a outra como molde.

Ou seja, para realizar esta técnica é necessário o aquecimento do ADN, a adição de um primer, a adição de nucleótidos livres e de ADN polimerase e a repetição dos ciclos de aquecimento e arrefecimento até se obterem as cópias necessárias ao estudo;

Electroforese

A electroforese é a técnica básica da Biologia Molecular que permite a separação de fragmentos de moléculas de diferentes tamanhos. Significa “transportar através da electricidade”.

As moléculas de ADN têm carga total negativa; quando em suspensão numa solução electrolítica (com iões em suspensão) podem ser separadas através da aplicação de um campo eléctrico. É utilizada, por exemplo, para visualizar fragmentos provenientes da digestão por enzimas de restrição.

Figura  4: Montagem do material necessário para realizar a electroforese;

ADN

O ADN, ácido Desoxirribonucleico, é uma molécula biológica universal presente em todas as células vivas. É no ADN que está contida toda a nossa informação genética, sob a forma de genes. A forma como cada um de nós é, resulta da interacção dos nossos genes com o ambiente que nos rodeia, desde que somos concebidos até à morte.

O ADN é constituído por quatro tipos de nucleótidos, unidade básica do ADN (que por sua vez é constituído por uma pentose, um grupo fosfato e uma base azotada – figura 5), que se associam de uma forma específica, formando uma cadeia dupla: adenina (A). Os nucleótidos são designados deste modo devido às bases azotadas que entram nas suas constituições. É possível ler a cadeia de ADN, obtendo-se uma sequência de letras, como por exemplo, ATGATTCTGTAGCCTGATCCC,   a uma sequência completa de ADN dá-se o  nome de genoma.

Figura  5: Exemplo de um nucleótido (timina);

O ADN tem a forma de uma escada de corda enrolada, ou seja, de uma hélice dupla em que os degraus são formados por pares de bases azotadas ligadas entre si, através de ligações de hidrogénio, com fundamento na complementaridade de bases (ver figura 6). A estrutura, do ADN, foi proposta há 53 anos por James Watson e Francis Crick. A descoberta da estrutura do ADN abriu o caminho para se compreender como é que a informação genética é transmitida de progenitores para descendentes, ou de uma célula para outra, isto é, como funciona a hereditariedade.

Figura  6: ADN;

Formação do gel de agarose

O gel de agarose é formado por uma grama de agarose e 100 milímetros de solução de TAE. Estes são colocados no matraz e posteriormente levados ao microondas. Depois de retirado do microondas, coloca-se o gel no tabuleiro de electroforese (ver figura 7) e antes de solidificar, é perfurado para assim formar os poços.

Já solidificado, o gel é colocado na tina de electroforese com os pólos submersos de solução.

Figura 7: Formação do gel de agarose;

Desenvolvimento Prático

1.   O rastreio dos transgénicos

Esta actividade dividiu-se em duas partes: a 1ª parte consistiu em testar se os alimentos eram ou não transgénicos e a 2ª parte foi um debate sobre os alimentos transgénicos. Para a 1ª parte da actividade a turma dividiu-se em cinco grupos (dois pares e três trios), de forma a verificar se os alimentos (tomate, soja e milho) eram transgénicos comparando-os com o controlo positivo (solução transgénica) e controlo negativo (ervilhas não transgénicas). Para a 2ª parte dividimo-nos em dois grupos, um a favor e outro contra os transgénicos para um debate.

1ª PARTE

Material utilizado

. Alimentos a testar (no nosso caso, o tomate)

. Almofariz

. Água destilada

. Microtubos de PCR

. Suporte de microtubos

. Micropipetas

. Pontas reutilizáveis

. Esguichos

. Gobelé de 250 ml

. Proveta de 25 ml

. Solução de InstaGeneTMMatrix

. MasterMix Plant PS11 (primer verde)

. MasterMix GMO (primer vermelho)

. Balança electrónica

. Bloco térmico

. Termociclador

. Centrifugadora

. Tina de electroforese

. Placa de gel de agarose

. Fonte de alimentação

. Corante para o gel de agarose (Fart Blast DNA Stain)

Procedimento

Já com as amostras dos alimentos preparadas pelas monitoras da actividade e com todo o material necessário à disposição dos grupos, a actividade foi iniciada:

Etapa 1 – Extracção de ADN

. Colocou-se 10 ml de água destilada numa proveta com o auxílio de um esguicho;

. Pesou-se na balança duas gramas de tomate e colocou-se no almofariz;

. Adicionou-se ao almofariz com o tomate a água destilada anteriormente medida e macerou-se o tomate;

. Colocou-se num microtubo 500 μl de solução InstaGeneTMMatrix com o auxílio de uma micropipeta de 100/1000 μl;

. Com uma micropipeta de 20/200 μl retirou-se 50 μl de sobrenadante do tomate para o microtubo que continha a solução InstaGeneTMMatrix;

Figura  8: Maceração do tomate;

. De seguida, cada grupo identificou o seu microtubo, escrevendo a inicial do material em teste ou +/ – (no caso do controlo positivo e negativo);

. Depois colocou-se todos os microtubos no bloco térmico (figura 9) a 95ºC durante um minuto;

. Retirou-se os microtubos do bloco térmico e colocou-se na centrifugadora durante dois minutos a 13 000 rotações por minuto;

Figura 9: Bloco térmico;

Etapa 2 – Amplificação do ADN (PCR)

. Observou-se o depósito dos microtubos quando se retirou da centrifugadora e com uma micropipeta de 2/20 μl pipetou-se 20ml de sobrenadante do microtubo para um microtubo de PCR com o MasterMix Plant PS11 (primer verde) e outros 20 ml para um outro microtubo de PCR com o MasterMix GMO (primer vermelho).

. Colocaram-se os microtubos de PCR no termociclador (figura3);

Etapa 3 – Electroforese e observação dos resultados

. Retirou-se os microtubos do termociclador e colocou-se o gel de agarose na tina de electroforese com os pólos subrmersos de solução;

. Carregou-se com o auxílio de uma micropipeta de 2/20 μl 10 ml de preparação de cada microtubo de PCR e colocou-se nos poços existentes no gel de agarose;

. Após os poços estarem todos preenchidos com as preparações (dois poços por cada grupo de trabalho), fechou-se a tina e ligou-se a 120 voltes durante 40 minutos a fonte de alimentação de forma às amostras migarem do pólo negativo para o positivo;

. Como não poderíamos esperar o tempo necessário para que a electroforese se realiza-se, observou-se nos primeiros minutos o que acontecia dentro da tina e depois foi-nos mostrado o resultado da actividade, esta que havia preparado anteriormente à nossa chegada.

Figura 10: A- Material necessário para a electroforese; B- Carregamento de poços; C- Início da migração das moléculas de ADN;

Resultados

No final da actividade foi possível observar os resultados e todos os grupos chegaram à conclusão que entre os alimentos - tomate, soja e milho - o alimento transgénico era a soja, uma vez que, era o único que apresentava as mesmas características do controlo positivo (solução transgénica). O tomate e o milho apresentavam as características do controlo negativo (ervilhas não transgénicas), logo não são considerados transgénicos (ver figura 11 – página 11).

Conclusões

Esta actividade permitiu que percebêssemos a forma de como se pode apurar se um alimento é ou não transgénico (alimento geneticamente modificado).

Isto quer dizer que, no final desta actividade pudemos comprovar que alimentos transgénicos são combinações de características de alimentos existentes com características desejadas pelos humanos de forma a aumentar o seu consumo e satisfazer os consumidores.

                                       Organismo geneticamente modificado positivo

Figura 11: Resultados da electroforese;

2ª PARTE

Como já referi, esta parte consistia num debate e a turma foi dividida em dois grupos. O grupo a favor era constituído por sete elementos (Catarina Torres, Claúdia Pereira, Dina Coelho, Fábio Marques, Janine Martins, José Fernando, Patrícia Faria) e o grupo contra por seis (Eduardo, Gil Pereira, Luís, Sara Rocha, Sofia Machado e Valentina Pinheiro).

Foram disponibilizados pelas monitoras vinte minutos para a análise dos textos, de forma a encontrarem argumentos que sustentassem as suas posições.

Após os vinte minutos, o debate iniciou-se. Todo o debate foi moderado pelas monitoras. Ao longo do debate surgiram vários argumentos.

Tabela 1: Argumentos apresentados por cada grupo;

Após a discussão, as monitoras pediram para esquecermos as “rivalidades” e para nos focarmos nos aspectos mais importantes. Num diálogo aberto entre elas e os alunos, concluiu-se que todos consumimos transgénicos, mesmo sem saber, pois ainda existe pouca informação acerca disto. Ainda não existem estudos onde se observe consequências graves no consumo destes alimentos, mas também não existem estudos que as neguem, ou seja, continuamos numa incerteza.

Mas existem grandes vantagens dos alimentos transgénicos, tais como, a sua elevada resistência e durabilidade e a criação de nutricêuticos que permite nutrir e medicar as pessoas (proporcionam benefícios à saúde).

Sendo assim, cabe a cada um decidir se consome ou não alimentos transgénicos, apesar de mesmo sem sabermos os consumirmos diariamente, como frutas e até chocolates.

Figura 12: Imagem a favor e contra o consumo de alimentos transgénicos, respectivamente;

2.   O Código da Vida: O Criminoso

Esta actividade também foi dividida em duas partes. A primeira parte, consistia em mostrar como através de provas físicas ou biológicas, como roupa, pegadas, marcas de pneus, o sangue, pele, raiz do cabelo, entre outros se pode identificar o criminoso.

A segunda parte da actividade ocorreu no laboratório e a turma foi dividida em seis grupos (cinco pares e um trio). Um grupo ficou com o ADN encontrado no local do crime e os restantes grupos ficaram com o ADN dos cinco suspeitos do crime.

1ª PARTE

Prova Física

Material utilizado

. Luvas de látex;

. Mala com equipamento (cotonetes, pó de grafite, óculos, fita-cola, cartão FTA, pincel (entre outros));

. Gobelé com impressões digitais;

Procedimento

. Pulverizou-se com um pincel e pó de grafite o gobelé, sobre as impressões digitais;

. Colocou-se fita-cola no local onde surgiram as impressões digitais, para que estas ficassem marcadas na nela;

. Retirou-se a fita-cola do gobelé e colou-se num papel branco para posteriormente as impressões digitais serem observadas;

Resultados

Figura 13: Impressões digitais depois de retiradas do gobelé;

Conclusões

Foi possível concluir que se os criminosos não usarem luvas é possível obter o ADN destes analisando objectos que possivelmente tocaram.

Esta actividade terminou quando retiramos a fita-cola do gobelé e colocamos num papel, mas nos casos oficiais após este passo os investigadores inserem essas impressões numa base de dados de forma a conseguir identificar o criminoso (comparam com o ADN dos suspeitos e dos indivíduos com cadastro).

Prova Biológica

Esta prova consistia em extrair ADN através do sangue artificial.

Material utilizado

. Pontas esterilizáveis;

. Pinça;

. Microtubos;

. Tesoura;

. Solução de chelex a 5%;

. Gobelé de 500 ml;

. Micropipetas;

. Tubos de ensaio;

. Suporte para tubos de ensaio;

. Esguicho

. Água destilada

. Pipeta de 10 ml;

. Provetas volumétricas;

. Mala com equipamento;

. Vidro de relógio com sangue artificial;

Procedimento

. Retirou-se com uma ponta esterilizada o sangue artificial do vidro de relógio;

Figura 14: Recolha de algodão com sangue;

. Com uma pinça retirou-se um bocado de algodão com sangue da ponta e colocou-se num microtubo;

. Colocou-se água nesse microtubo e noutro que continha um cartão FTA com sangue;

. Colocou-se os microtubos no agitador, durante vinte minutos;

. Os microtubos foram retirados do agitador e com uma pinça recolheu-se o papel de dentro do microtubo e o bocado de algodão que estava dentro do outro microtubo;

. Para separar o material celular do plasma, colocou-se a água destilada com o sangue artificial no centrifugador, durante quinze minutos, a 8000 rotações por minutos;

. Depois de retirados do centrifugador, com uma micropipeta recolheu-se o plasma e deixou-se apenas o depósito dentro do microtubo;

. Juntou-se ao depósito com uma micropipeta a solução de chelex a 5%, esta solução contem resinas que aprisionam os co-factores para as ADNASES não degradarem o ADN) e colocou-se a preparação no bloco térmico a 56ºC (figura 9);

Ilustração 15: Centrifugador;

Resultados

Foi possível observar-se que a única parte da solução que nos interessada era o sobrenadante pois o deposito continha partes da resina adicionada à mesma. O sobrenadante é onde se encontram os glóbulos brancos do sangue que possuem o ADN, isto era o objectivo inicial da actividade, extrair o ADN do suspeito do sangue encontrado no local do crime.

Conclusões

Concluímos então que ao colocar sangue artificial num microtubo e este ser colocado na centrifugadora, é possível separar os constituintes do sangue – hemácias, plaquetas e glóbulos brancos. Como já referi nos resultados o objectivo era obter os glóbulos brancos do indivíduo para assim termos o ADN.

Ou seja, foi possível perceber de que forma nos casos oficiais fazem para obter o ADN do possível criminoso a partir de sangue que encontram no local do crime.

2ª PARTE

Material utilizado

. Micropipeta de 2/20 μl;

. Golelé de 250ml;

. ADN do local do crime;

. Corante (loading die);

. Gobelé de vidro de 100ml;

. Pontas esterilizáveis;

. Microtubos;

. Enzima EcoR1;

. Enzima Pst1;

. Tina de electroforese

. Placa de gel de agarose

. Fonte de alimentação

Procedimento

. Começamos por retirar 10 μl de ADN (no nosso caso, era o suspeito número 2 – figura 16), com o auxílio de uma micropipeta;

. Colocou-se a solução extraída no microtubo;

. Nesse microtubo que continha o ADN, foi adicionada as enzimas EcoR1 e Pst1;

Figura 16: ADN do suspeito número 2;

. Como as enzimas encontravam-se inactivas, o microtubo foi colocado na estufa a 35º C durante 45 minutos (temperatura corporal);

. As amostras já continham o corante de carregamento – loading dye;

. Os microtubos foram retirados da estufa e com uma micropipeta de 20/200 μl retirou-se 10 μl da solução e esta foi colocada nos poços do gel de agarose dentro da tina de electroforese;

. Fechou-se a tina e ligou-se a fonte de alimentação, a cem voltes durante trinta minutos. Assim as amostras migraram do pólo negativo para o pólo positivo (electroforese);

. Depois dos trinta minutos colocou-se o gel numa tina com corante Fat Blast DNA STAIN;

Figura 17: Carregamento dos poços;

Resultados

Todos os grupos observaram a tina para identificar o criminoso. O resultado foi que o criminoso era o suspeito número 3, pois os fragmentos de ADN obtidos após a electroforese correspondiam aos fragmentos da amostra de DNA do local do crime. Nenhum outro suspeito tinha o mesmo perfil do ADN do local do crime (ver figura 15).

Conclusões

No final desta actividade, concluiu-se que através da electroforese é possível proceder-se à comparação de ADN (de suspeitos e do criminoso) de forma a identificar o verdadeiro culpado do crime.

Isto acontece pois cada ser vivo tem um ADN próprio que o torna único (excepto os gémeos homozigóticos). Porém esta técnica em tribunal é considerada uma técnica de apoio e nunca uma prova.

Figura 18: Resultados da electroforese da actividade 2;

Conclusão final

Após a realização desta visita de estudo ao IPATIMUP e do presente relatório, concluo que a visita foi completamente positiva, pois permitiu que todos os alunos aprofundassem o conhecimento acerca disto, percebessem melhor a matéria dada anteriormente e alargassem o conhecimento a nível laboratorial, conhecendo novos instrumentos e técnicas. Para além disso as actividades foram interessantes.

Permitiu também que a professora avaliasse o nosso comportamento e conhecimentos sobre a matéria leccionada. Sobre este último ponto, posso dizer que influenciou a professora a mudar a sua estratégia de avaliação/ dar a matéria.

Posto isto, foi um dia diferente e enriquecedor para a turma.

Referências bibliográficas

Livros:

. Amparo Dias Da Silva, Maria Ermelinda Santos, Almira Fernandes Mesquita, Ludovina Baldaia, José Mário Félix (2009). Terra, Universo de Vida (1ª edição). Porto: Porto Editora.

. Diapositivos fornecidos pela professora Sara Soares – ano lectivo 2010/2011

. Diapositivos fornecidos pela professora La Salete Carvalho à turma 12.1 do ano lectivo 2009/2010;

Recursos electrónicos:

. NotaPositiva (07/03/2006). ADN - Símbolo de Vida. Retirado ‎a 19‎ de ‎Fevereiro‎ de ‎2011 em: http://www.notapositiva.com/trab_estudantes/trab_estudantes/biologia/

   biologia_trabalhos/adn.htm

. CienTic. PCR e Electroforese em gel. Retirado a 18‎ de ‎Fevereiro‎ de ‎2011 em: http://www.cientic.com/portal/index.php?view=article&catid=42%3Amaterial-genetico&id=66%3Apcr-e-electroforese-em-gel&option=com_content&Itemid=112

. Algosobre. Alimentos Transgénicos. Retirado a 18‎ de ‎Fevereiro‎ de ‎2011 em: http://www.algosobre.com.br/biologia/alimentos-transgenicos.html

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